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α-淀粉酶 ( α-AL) 活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體 20mL×1 瓶，室溫保存。若有黃色晶體析出，可適當加熱溶解后再用。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 10mL 蒸餾水，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間 不斷攪拌粉劑至溶解。

標準品：粉劑×1 支，10mg 無水葡萄糖，臨用前加 1mL 蒸餾水，配成 10mg/mL 葡萄糖標準液。

產(chǎn)品說明：

淀粉水解酶，包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-AL (EC 3.2. 1. 1)隨機催化淀粉中α- 1,4-糖苷鍵水解，生 成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉的粘度降低，因此又稱為液化酶。

淀粉水解酶催化淀粉水解生成還原糖，還原糖還原 3,5-二硝基水楊酸生成棕紅色物質(zhì)，在 540 nm 有吸收峰；通過測定 540 nm 吸光度增加速率，計算淀粉酶活性。α-AL 耐熱，但是β-淀粉酶可在 70℃ 鈍化 15min 。因此粗酶液經(jīng)過 70℃鈍化 15min ，就只有α-AL 能夠催化淀粉水解。

需自備的儀器和用品：

酶標儀或可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、96  孔板/微量比色皿、 研缽和蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取：

稱取約 0. 1g 樣本，加 0.8 mL 蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取 15min ，每隔 5min 振蕩 1

次，使其充分提取；6000g ，室溫離心 10min ，吸取上清液并且加蒸餾水定容至 10 mL ，搖勻，即為 淀粉酶原液。

二、測定步驟和加樣表 (在 EP 管中依次加入下列試劑)：

1 、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長到 540 nm ，蒸餾水調(diào)零。

2 、將葡萄糖標準液用蒸餾水稀釋為 1 、0.5 、0.25 、0. 125 、0.0625 、0.03125 、0.015625 、0.0078 和 0.0039mg/mL 的標準溶液。

3 、按操作表依次加入各試劑：

試劑 (μL)對照管測定管標準管空白管

α- 淀粉酶原液7575--

蒸餾水---75

標準溶液 (mg/mL)--75-

70℃水浴 15min 左右，冷卻

試劑一150---

將以上對照管、測定管和試劑二置于 40℃恒溫水浴中保溫 10min 左右

試劑二75757575

在 40℃恒溫水浴中準確保溫 5min

試劑一-150150150

混勻，90℃ 水浴 10min ，取 200μL 至 96 孔板或微量比色皿中，540nm 處讀取對照管、測定管、 標準管、空白管的吸光度，分別記為 A 對照、A 測定、A 標準和 A 空白，計算ΔA 測定=A 測定-A 對照，ΔA 標準=A 標準-A 空白。

三、α-淀粉酶活性計算：

1 、標準曲線的繪制

以ΔA 標準為 y 軸，以標準溶液濃度為 x 軸，繪制標準曲線，得到方程 y=kx+b 。將ΔA 測定帶 入方程得到 x  (mg/mL)。

2 、α- 淀粉酶活性的計算

a.        按照樣本鮮重計算

單位定義：每g 組織每分鐘催化產(chǎn)生1mg  還原糖定義為1個酶活力單位。

α-  淀粉酶活性(mg/min/g  鮮重)=x×V  樣÷(W×V  樣÷V  樣總)÷T=2×x÷W

b.       按照蛋白質(zhì)濃度計算

單位定義：每mg  組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1mg 還原糖定義為1個酶活性單位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= x×V 樣÷  (V 樣×Cpr) ÷T=0.2×x÷Cpr

V  樣：加入反應體系中樣本體積，0.075 mL；V  樣總：提取液總體積，10 mL；  Cpr：樣本蛋

白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；T ：反應時間，5min。

注意事項：

當測定的吸光值大于 1.5 時，可以對樣本進行適當稀釋后測定。

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