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丙二醛(malondialdehyde ，MDA)含量試劑盒說明書 微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復(fù)雜的化 合物，其中包括MDA 。通過檢測MDA的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平。

測定原理：

MDA與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid ，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在532nm有最大吸 收峰，進(jìn)行比色后可估測樣品中過氧化脂質(zhì)的含量；同時測定600nm下的吸光度，利用532nm 與600nm下的吸光度的差值計算 MDA  的含量。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96  孔板、 研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 100mL× 1  瓶，4℃保存；

試劑一：液體 30mL× 1  瓶，4℃保存；

注意事項：

臨用前注意試劑一是否完全溶解，如未溶解，可以70℃加熱，并振蕩以促進(jìn)溶解。

MDA  提取：

1 、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（mL）為500~ 1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）， 超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W ，超聲3s ，間隔10s ，重復(fù)30次）；8000g 4℃ 離心10min ，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~ 10的比例（建議稱取約0. 1g組織，加 入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min ，取上清，置冰上待測。

2 、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1 、吸取0.3mL試劑一于1.5mL離心管中，再加入0. 1mL樣本,  混勻。

2、95℃水浴中保溫30min（蓋緊，防止水分散失），置于冰浴中冷卻，10000g，25℃ , 離心10min。 3、吸取200μL上清液于微量石英比色皿或96孔板中，測定532nm和600nm處的吸光度，記為A532  和A600 ，ΔA= A532-A600。

MDA  含量計算：

a.  用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1 、血清（漿）中 MDA  含量的計算：

MDA  含量(nmol/ mL)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷V  樣=25.8 ×ΔA

2 、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中 MDA  含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

MDA含量(nmol/mg prot)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(Cpr×V  樣)=25.8 ×ΔA ÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA  蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計算

MDA含量(nmol/g  鮮重)=[ ΔA×V反總÷(ε×d)× 109]÷(W×V樣÷V樣總)

=25.8 ×ΔA ÷W

(3 )  按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(500×V  樣÷V  樣總)=0.0516×ΔA

V  反總：反應(yīng)體系總體積， 4 × 10-4L；ε ：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155× 103L/mol/cm；d：比色 皿光徑，1cm；V  樣：加入樣本體積，0. 1 mL；V  樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本 蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。

b.用96  孔板測定的計算公式如下

1 、血清（漿）中 MDA  含量的計算：

MDA含量(nmol/mL)=[ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷V  樣=51.6 ×ΔA

2 、細(xì)菌、細(xì)胞或動物組織中 MDA  含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

MDA含量(nmol/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)× 109]÷(Cpr×V  樣)=51.6 ×ΔA÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計算

MDA含量(nmol/g  鮮重)=[ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(W×V樣÷V樣總)=51.6 ×ΔA÷W (3 )  按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

MDA含量(nmol/104)=[ ΔA×V  反總÷(ε×d)× 109]÷(500×V  樣÷V  樣總)=0.1032×ΔA

V  反總：反應(yīng)體系總體積，4 × 10-4L；ε ：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155× 103L/mol/cm；d：96孔板 光徑，0.5cm；V  樣：加入樣本體積，0. 1 mL；V  樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本 蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500  萬。

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